如何设计sirna？设计siRNA的关键原则和方法如下：设计原则： 位置选择：理想的siRNA应在靶基因的AUG下游50至100个核苷酸内寻找，靠近3’端的序列通常效果更佳。 序列格式：推荐使用AAUU或NAUU/NANN格式，其中N代表任意核苷酸，n为核苷酸数量，且1929个核苷酸最有效，过长可能导致非特异性效果。那么，如何设计sirna？一起来了解一下吧。
1.化学合成
尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer
siRNA Construction Kit为例，一旦得到DNA
Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。
siRNA设计是一个复杂的过程，目前尚无明确的通用规律，主要依赖于实验方法。首先，虽然实验分析能确定特定基因的最优siRNA作用区域，但这耗时且成本高，不建议常规使用。一种策略是为每个目标基因设计3-4对siRNAs，通过实验来筛选最有效的那一部分。
设计siRNA通常参考Tuschl的实验指导，步骤如下：
从基因的开放阅读框起始密码后的75-100碱基处寻找“AA”序列之后的19个碱基，非“AA”的“XY”序列也可，但应避免针对5’和3’端非编码区，因为它们可能受调控蛋白影响。
优选GC含量在40-55%的靶基因序列，避免与编码序列或EST同源。
使用BLAST等工具进行序列比对，排除同源性。
shRNA设计通常建议9个核苷酸环，但GC含量30-50%的siRNA效果可能更好。
设计时，需记住5’和3’非编码区的特殊性，以及合成siRNA可能需要多个靶序列来优化效果。同时，负对照必不可少，它应与选中的siRNA序列相同但不与mRNA有同源性，可通过打乱顺序来实现。
现有一些工具如Qiagen公司的网站提供自动siRNA设计服务，可以生成备选序列并进行基因组比对，简化了设计流程。
扩展资料
Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。
siRNA的原理、引物设计与细胞转染的要点如下：
一、siRNA原理RNA干扰机制：siRNA是RNA干扰现象的关键分子，通过双链RNA降解靶向互补mRNA，从而引发基因沉默。 作用过程：siRNA通过一系列步骤完成基因沉默，包括被加工成成熟形式、与RISC结合、引导链与靶mRNA结合并导致mRNA切割。
二、siRNA引物设计位置选择：应靶向距离靶基因3′端50～100个核苷酸的位置，以确保最佳沉默效果。 序列长度与模式：序列长度一般在19～29nt之间，理想序列模式为AA+UU或NA UU或NA NN。 G/C含量：G/C含量在30%～52%的siRNA序列效果最佳。 稳定性增强：确保3′端2个碱基为dTdT结构，以增强双链复合体稳定性。 避免不良序列：避免连续碱基和反向重复序列，选择合适的双链内在稳定性。
在线设计siRNA是基因研究中常用的技术。siRNA通过与靶向特异性的mRNA结合，引发RNA介导的沉默复合体RISC介导的mRNA降解，实现转录后基因沉默。siRNA长度通常为21-23nt，通过RISC识别结合后，siRNA发生解旋。在siRNA反义链的指导下，RISC在具有同源序列的内源性mRNA附近进行切割，导致mRNA的降解。
以下是三种常用的siRNA在线设计网站：
1. siDirect设计网站（sidirect2.rnai.jp/）
输入NCBI序列号或序列信息（FASTA格式），点击"design siRNA"。网站将提供一系列siRNA设计，包括Tm值、脱靶效应等评估信息。
2. DSIR设计网站（biodev.extra.cea.fr/DSI...）
输入RNA名字和序列（FASTA格式），点击"Run analysis"。网站根据评分高低排序设计的siRNA，去除评分低于90分的siRNA，选择排名靠前的siRNA进行设计。
3. invivogen设计网站（invivogen.com/sirnawiza...）
输入RNA序列，点击"search"。网站不仅提供siRNA序列，还提供shRNA序列设计。
RNA 干扰实验的操作步骤如下：
设计 siRNA：
从靶基因转录本的 AUG 起始密码子开始，寻找“AA”及之后 3’端相邻的 19 个碱基序列作为潜在的 siRNA 靶向位点。
确保 siRNA 序列的 GC 含量在 30%60% 左右。
避免连续的单一碱基和反向重复序列。
避免针对 5’和 3’端的非编码区。
将潜在的靶向位点与相应的基因组数据库进行对比，避免与其他基因编码序列具有超过 1617 个连续碱基对同源性。
一个基因需要设计多个靶基因的 siRNA，通过实验确认最有效的 siRNA 序列。
细胞准备：
选择合适的细胞系进行培养，确保细胞状态良好。
在转染前，根据实验需求调整细胞密度。
siRNA 转染：
选择合适的转染方法，如磷酸钙共沉淀、电穿孔法、阳离子脂质体试剂等。MCE 推出的最新转染试剂 HYK2017 可用于高效率转染 siRNA。
按照转染试剂的说明书制备转染复合物，并加入细胞中。
转染后，根据试剂说明书和细胞特性确定适当的培养时间。
验证 siRNA 效果：
通过 RTPCR 或 Western blot 等方法检测靶基因的 mRNA 和蛋白水平，以验证 siRNA 的沉默效果。
以上就是如何设计sirna的全部内容，确定你想要“静音”的基因，例如Mettl1。通过NCBI的RefSeq数据库找到对应的基因Accession Number。使用专业工具设计siRNA：借助专业工具，如BLOCKiT? RNAi Designer。输入Accession Number，并锁定目标区域。确认研究对象，例如Mus musculus。筛选候选siRNA：在工具中查看生成的候选siRNA序列，内容来源于互联网，信息真伪需自行辨别。如有侵权请联系删除。
